ELISA试剂盒(酶联免疫分析测试法)实验操作中常见问题分析（三）

   测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，两次在zui适波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测定间不 移动ELISA 板的位置，zui终测得的A 值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。 肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。

   融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断 试剂 盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。少数 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者zui低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。

   a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变(氨基酸58～118)是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。